Pharmaceutical Entrepreneur

Validasi metode analisis adalah suatu tindakan penilaian terhadap parameter tertentu berdasarkan percobaan laboratorium, untuk membuktikan bahwa parameter tersebut memenuhi persyaratan untuk penggunaannya (Harmita, 2004). Menurut Harvey (2000), validasi merupakan suatu proses evaluasi kecermatan dan keseksamaan yang dihasilkan oleh suatu prosedur dengan nilai yang dapat diterima. Sebagai tambahan, validasi memastikan bahwa suatu prosedur tertulis memiliki detail yang cukup jelas sehingga dapat dilaksanakan oleh analis atau laboratorium yang berbeda dengan hasil yang sebanding.

Verifikasi metode adalah suatu tindakan validasi metode tetapi hanya pada beberapa beberapa karakteristik performa saja. Laboratorium harus menentukan karakteristik performa yang dibutuhkan. Spesifikasi analisis dapat menjadi acuan untuk merancang proses verifikasi. Rancangan yang baik akan menghasilkan informasi yang dibutuhkan serta meminimalisir tenaga, waktu, serta biaya. Pemilihan parameter validasi atau verifikasi tergantung pada beberapa faktor seperti aplikasi, sampel uji, tujuan metode, dan peraturan lokal atau internasional.

Verifikasi dilakukan terhadap suatu metode baku sebelum diterapkan di laboratorium. Verifikasi sebuah metode bermaksud untuk membuktikan bahwa laboratorium yang bersangkutan mampu melakukan pengujian dengan metode tersebut dengan hasil yang valid. Disamping itu verifikasi juga bertujuan untuk membuktikan bahwa laboratorium memiliki data kinerja. Hal ini dikarenakan laboratorium yang berbeda memiliki kondisi dan kompetensi personil serta kemampuan peralatan yang berbeda, sehingga kinerja antara satu laboratorium dengan laboratorium lainnya tidaklah sama.

Di dalam verifikasi metode, kinerja yang akan diuji adalah keselektifan, seperti uji akurasi (ketepatan) dan presisi (kecermatan). Dua hal ini merupakan hal yang paling minimal harus dilakukan dalam verifikasi sebuah metode. Suatu metode yang presisi (cermat) belum menjadi jaminan bahwa metode tersebut dikatakan tepat (akurat). Begitu juga sebaliknya, suatu metode yang tepat (akurat) belum tentu presisi.

Sedangkan validasi digunakan untuk metode tidak baku, metode yang dikembangkan sendiri oleh laboratorium, atau metode baku yang dimodifikasi. Validasi dilakukan untuk memastikan bahwa metode pengujian maupun kalibrasi tersebut sesuai untuk penggunaan yang dimaksudkan, dan mampu menghasilkan data yang valid. Dalam melakukan validasi metode, parameter yang harus diuji meliputi: presisi, akurasi, batas deteksi (LoD), batas kuantitasi (LoQ), selektivitas, linieritas, repitabilitas, reproduksibilitas, ketahanan (robustness), sensivitas silang (cross-sensitivity), dsb.

Verifikasi maupun validasi keduanya merupakan proses yang terdokumentasi, artinya hasil dari kegiatan tersebut harus tercatat sebagai record dan disimpan mengikuti ketentuan klausa 4.13 pada ISO/IEC 17025:2005.

Adapun beberapa parameter analisis yang harus dipertimbangkan dalam verifikasi metode analisis :

Akurasi

Akurasi atau kecermatan adalah ukuran yang menunjukan derajat kedekatan hasil analis dengan kadar analit yang sebenarnya. Terkadang masalah dalam menentukan akurasi adalah ketidaktahuan terhadap nilai yang sebenarnya. Dalam beberapa tipe sampel kita dapat menggunakan sampel yang telah diketahui nilainya dan mengecek metode pengukuran kita gunakan untuk menganalisis sampel itu sehingga kita mengetahui akurasi dari prosedur yang diujikan, metode ini disebut dengan CRM(Certified Reference Method). Pendekatan lain adalah dengan membandingkan hasilnya dengan hasil yang dilakukan oleh laboratorium lain atau dengan menggunakan metode referen. Akurasi juga dapat diketahui dengan melakukan uji peoleahan kembali (recovery). Hasil uji ini akurasi dapat dinyatakan sebagai persen perolehan kembali (recovery) analit yang ditambahkan pada sampel. Rentang nilai penerimaan kecermatan suatu metode akan bervariasi sesuai kebutuhannya. Adapun AOAC menetapkannya seperti dalam Tabel 1.

Tabel 1 Persentase recovery yang dapat diterima sesuai dengan konsentrasi analit

(%) analit Unit Rata-rata recovery (%)

100 100% 98-102

10 10% 95-102

1 1% 97-103

0.1 0.10% 95-105

0.01 100 ppm 90-107

0.001 10 ppm 80-110

0.0001 1 ppm 80-110

0.00001 100 ppb 80-110

0.000001 10 ppb 60-115

0.0000001 1 ppb 40-120

(sumber: AOAC 2002)

Sampel ditambahkan (spiking) dengan standar yang telah diketahui jumlah dan kadarnya. Kadar analit dalam penambahan baku dapat dihitung sebagai berikut;

C = kadar analit dalam sampel

S = kadar analit yang ditambahkan pada sampel

R₁ = respon yang diberikan sampel

R₂ = respon yang diberikan campuran sampel dan analit

Perhitungan perolehan kembali dapat juga ditetapkan dengan rumus sebagai berikut :

C_F = konsentrasi total sampel yang diperoleh dari pemgukuran

C_A = konsentrasi sampel sebenarnya

C*_A = konsentrasi analit yang ditambahkan
(Harmita, 2004).

Presisi

Presisi adalah ukuran yang menunjukkan derajat kesesuaian antara hasil uji individual, diukur melalui penyebaran hasil individual dari rata-rata jika prosedur diterapkan secara berulang pada sampel-sampel yang diambil dari campuran yang homogen (Harmita, 2004). Presisi dapat dibagi dalam dua kategori yaitu keterulangan atau ripitabilitas (repeatability) dan ketertiruan (reproducibility). Ripitabilitas adalah nilai presisi yang diperoleh jika seluruh pengukuran dihasilkan oleh satu orang analis dalam satu periode tertentu, menggunakan pereaksi dan peralatan yang sama dalam laboratorium yang sama. Ketertiruan adalah nilai presisi yang dihasilkan pada kondisi yang berbeda, termasuk analis yang berbeda, atau periode dan laboratorium yang berbeda dengan analis yang sama. Karena ketertiruan dapat memperbanyak sumber variasi, ketertiruan dari analisis tidak akan lebih baik hasilnya dari nilai keterulangan. Presisi dalam hal ripitabilitas diukur dengan menghitung relative standard deviation atau simpangan baku relatif (RSD) dari beberapa ulangandan dari nilai simpangan baku tersebut dapat dihitung nilai koefisien varian (KV). Dari nilai KV yang diperoleh dibandingkan dengan KV Horwitz yaitu suatu kurva berbentuk terompet yang menghubungkan reproducibilitas (presisi yang dinyatakan sebagai %KV) dengan konsentrasi analit. Presisi metode analisis diekspresikan sebagai fungsi dari konsentrasi melalui persamaan :

KV _Horwits = 2 ^{1-0,5 log C}

Dengan menggunakan pembanding KV Horwits nilai yang dapat diterima untuk ripitabilitas adalah KV yang terhitung dari ulangan yang ada harus kurang dari 2/3 dari nilai KV Horwits (Harvey, 2000).

Linieritas

Linieritas metode analisis menunjukkan kemampuan suatu metode untuk memperoleh hasil uji, yang baik langsung maupun dengan definisi transformasi matematis yang baik, proporsional dengan konsentrasi analat dalam sampel pada range tertentu (Leyva, 2008). Linieritas dapat diuji secara informal dengan membuat plot residual yang dihasilkan oleh regresi linier pada respon konsentrasi dalam satu seri kalibrasi (Thompson, 2002). Linieritas harus dievaluasi dengan pemeriksaan visual terhadap plot absorbansi yang merupakan fungsi dari konsentrasi analat. Jika hubungannya linier, hasil uji dievaluasi lebih lanjut secara statistik dengan perhitungan garis regresi. Dalam penentuan linieritas, sebaiknya menggunakan minimum lima konsentrasi. Rentang penerimaan linieritas tergantung dari tujuan pengujian. Pada kondisi yang umum, nilai koefisien regresi (r²) ≥ 0,99 (EMA, 1995).

Sebagai parameter adanya hubungan linier digunakan koefisien korelasi r pada analisis regresi linier Y= aX+b. Hubungan linier yang ideal dicapai jika nilai a=0 dan r=+1 atau -1 bergantung pada arah garis. Sedangkan b menunjukan kepekaan analisis terutama instrumen yang digunakan. Nilai koefisien korelasi yang memenuhi persyaratan adalah sebesar ≥ 0,99970 (ICH, 1995), ≥ 97 (SNI) atau ≥ 0,9980(AOAC).

Limit Deteksi dan Limit Kuantitasi

Limit deteksi atau Limit of Detection (LOD) suatu metode analisis adalah jumlah terkecil dari analit yang dapat dideteksi namun jumlah ini belum tentu dapat dikuantisasi dengan presisi yang baik oleh metode tersebut. Limit kuantitasi atau Limit of Quantitation (LOQ) yang disebut juga limit determinasi adalah konsentrasi terendah dari analat yang dapat ditentukan secara kuantitatif dengan presisi dan akurasi yang dapat diterima. Giese dengan menentukan kurva kalibrasi menggunakan sepuluh level konsentrasi, atau melakukan analisis blanko berulang. Tetapi ada masalah dalam pendekatan menggunakan blanko karena seringkali sulit diukur dan variasinya sangat tinggi. Lebih lanjut, nilai yang didapat dengan pendekatan seperti ini tidak bergantung dari analit. Limit deteksi hanya berguna untuk mengontrol ketidakmurnian yang tidak diinginkan yang konsentrasinya harus tidak lebih dari level tertentu dan mengontrol kontaminan dengan konsentrasi rendah, sedangkan materi yang bermanfaat harus ada pada konsentrasi yang cukup tinggi agar dapat menjadi fungsional. Limit deteksi dan kuantitasi seringkali bergantung pada kemampuan instrumen (AOAC, 2002).

Pada analisis instrumen batas deteksi dapat dihitung dengan mengukur respon blanko beberapa kali lalu dihitung simpangan baku respon blanko dan formula di bawah ini dapat digunakan untuk perhitungan;

Q = LOD (batas deteksi) atau LOQ (batas kuantitasi)

K = 3 untuk batas deteksi atau 10 untuk batas kuntitasi

Sb = simpangan baku respon analit dari blanko

SI = arah garis linear ( kepekaan arah) dari kurva antara respon terhadap konsentrasi sama denganslope (b pada persamaan garis Y= a + bx).

Limit deteksi dan limit kuantisasi, limit deteksi (LOD) adalah konsentrasi terendah yang masih dapat terdeteksi oleh suatu alat. Besar limit deteksi biasanya dinyatakan dengan nilai rata-rata blangko + 3 S, dimana S adalah standar deviasi (simpangan baku) dari blangko. Sedangkan limit kuantitasi adalah konsentrasi terendah yang dapat ditentukan dengan besar presisi dan akurasi ynag dapat diterima. Besar limit kuantitasi biasanya dinnyuatakan dengan nilai rata-rata blanko +10 S.

Cara lain untuk menentukan batas deteksi dan kuantitasi adalah melalui penentuan rasio S/N (signal to noise ratio). Nilai simpangan baku blanko ditentukan dengan cara menghitung tinggi derau pada pengukuran blanko sebanyak 20 kali pada analit yang memberikan respon (Harmita, 2004).

Uji t dan F

Uji signifikansi meliputi uji t-student dan uji F . Uji t membandingkan rata-rata ulangan yang dilakukan oleh dua metode dan membuat asumsi dasar atau hipotesis nol, bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan antara nilai rata-rata dari dua set data (James, 1999). Uji t memberikan jawaban ya atau tidak terhadap pembenaran dari hipotesis nol dengan keyakinan yang pasti, seperti 95% atau bahkan 99%. Nilai kritik untuk t didapat dari tabel pada derajat bebas yang tepat. Jika nilai t hitung lebih besar dari nilai t tabel maka hipotesis nol dapat ditolak yang berarti terdapat perbedaan yang signifikan antara dua metode. Nilai t hitung didapat dari rumus;

dengan derajat bebas sebesar n₁+n₂-2

Uji F atau uji rasio-varian digunakan untuk membandingkan antara dua standar deviasi, yang berarti membandingkan pula ketelitian antara dua metode. Asumsi dasar atau hipotesis nol dari uji ini adalah bahwa tidak ada perbedaan yang signifikan antara dua standar deviasi. Hipotesis nol ditolak jika nilai F hitung lebih besar dari nilai F tabel yang berarti bahwa terdapat perbedaan yang signifikan antara ketelitian dua metode.

Nilai F hitung didapat dari rumus :

Keterangan : nilai s yang lebih besar ditempatkan sebagai pembilang sehingga F >1

Anova

Selain uji t dan F juga digunakan uji One Way Anova untuk menguji apakah rata-rata lebih dari dua sampel berbeda secara signifikan atau tidak. Hipotesis nol (H0) yaitu rata-rata populasi adalah identik, sedangkan hipotesis tandingannya (H1) yaitu rata-rata populasi tidak identik. H0 diterima jika nilai probabilitas > 0.05 dan H0 ditolak jika probabilitas < 0.05 (Santoso 2000).

Bahan Acuan

Bahan acuan memainkan peranan penting untuk mengeahui akurasi dalam melakukan validasi atau verifkasi. Bahan acuan disini dapat diartikan sebaga bahan atau zat yang memiliki sifat-sifat tertentu yang cukup homogen dan stabil yang telah ditetapkan untuk dapat digunakan dalam pengukuran atau dalam pengujian suatu contoh. Bahan acuan dapat digunakan untuk mengontrol presisi pengukuran walaupun bahan acuan tidak memiliki nilai acuan (assigned value), sedangkan untuk kalibrasi atau untuk mengontrol kebenaran pengukuran hanya bahan acauan yang memiliki nilai acuan yang dapat digunakan (Dara, 2010). Kalibrasi dan pengontrolan analisis sangat penting, karena menyangkut kehandalan hasil pengujian. Untuk pengambilan keputusan yang krusial diperlukan hasil pengujian yang dapat dipercaya (Nuryatini 2010).

Bahan acuan dapat dibagi menjadi dua yaitu Certified Reference Material (CRM) dan Standard Reference Material (SRM). CRM dapat ditelusur hingga standar internasional dengan ketidakpastian yang telah diketahui dan oleh karena itu dapat digunakan untuk mengukur semua aspek bias secara bersamaan, dengan asumsi bahwa tidak ada ketidaksesuaian matriks. Perlu dipastikan bahwa nilai ketidakpastian yang dimiliki cukup kecil sehingga dapat mendeteksi bias pada kisaran tertentu. Tetapi jika nilainya tidak cukup kecil, penggunaan CRM masih dianjurkan, tetapi dengan disertai dengan pengujian tambahan. Jika diperlukan dan dapat dilakukan, sejumlah CRM yang sesuai dengan matriks dan konsentrasi analit sebaiknya diujikan.

SRM dapat digunakan jika tidak ada CRM. SRM adalah material yang telah dikarakterisasi dengan baik untuk tujuan validasi. Hal yang perlu diperhatikan adalah jika nilai bias tidak signifikan, hal ini bukan berarti merupakan bukti bahwa tidak adanya bias sama sekali. Akan tetap jika terdapat bias yang signifikan, hal ini menandakan perlunya investigasi lebih lanjut. SRM dapat berupa material yang telah dikarakterisasi oleh produsen CRM tetapi tidak dilengkapi dokumen mengenai nilai ketidakpastiannya atau material yang telah terkualifikasi oleh sebuah manufakturer; materials yang dikarakterisasi dalam laboratorium sebagai reference material, dan material yang didistribusikan dalam proficiency test. Meskipun ketertelusuran dari material tersebut dipertanyakan, jauh lebih baik untuk menggunakan material tersebut dibandingkan tidak melakukan pengukuran terhadap bias sama sekali. Material dapat digunakan dengan cara yang sama seperti CRM, sekalipun tidak ada nilai ketidakpastian yang tercantum, seluruh pengujian yang signifikan bergantung seluruhnya pada presisi yang dapat diamati dari hasil (Thompson, 2002).

Validasi proses

Validasi proses adalah cara pemastian dan memberi pembuktian terdokumentasi bahwa proses (berlangsung dalam parameter desain yang telah ditentukan) mampu dan dapat dipercaya menghasilkan produk yang sesuai dengan kualitas yang diinginkan dan memiliki tingkat keberulangan yang tinggi. Dalam validasi proses salah satu yang perlu diperhatikan adalah tahap pengambilan contoh. Ada perbedaan antara pengambilan contoh sediaan padat (tablet) dan sediaan krim.

Sediaan Padat

Wadah dan peralatan yang bersih disiapkan kemudian ditulis dan ditempelkan label seperti di bawah ini:

v Nama produk

v Nomor batch / lot

v Besar batch / lot

v Tanggal pembuatan

v Tempat pengambilan contoh

v Tanggal pengambilan contoh

v Paraf

Contoh diambil pada tahap kritis sebelum proses sesuai dengan protokol validasi dari produk tersebut. Misal dalam bentuk tablet tidak bersalut diambil untuk pemeriksaan berat rata – rata, keseragaman berat dan keseragaman kadar. Pengambilan contoh dalam bentuk tablet bersalut (jika ada) diambil pada tahap subcouted, precolouring dan colouring untuk pemeriksaan susut pengeringan. Jumlah contoh yang diambil dicatat dan pada wadah yang diambil contohnya ditempelkan label “SAMPLE TAKEN”. Contoh tersebut dikirimkan ke laboratorium quality control dan mikrobiologi untuk diperiksa.

Sediaan Krim

Wadah dan peralatan yang bersih disiapkan kemudian ditulis dan ditempelkan label seperti di bawah ini:

v Nama produk

v Nomor batch / lot

v Besar batch / lot

v Tanggal pembuatan

v Tempat pengambilan contoh

v Tanggal pengambilan contoh

v Paraf

Pengambilan contoh krim dilakukan pada bagian atas, tengah dan bawah dari mesin penyampur untuk pemeriksaan keseragaman kadar, pH dan lain–lain. Jumlah contoh yang diambil dicatat dan pada wadah yang diambil contohnya ditempelkan label “SAMPLE TAKEN”. Contoh tersebut dikirimkan ke laboratorium quality control dan mikrobiologi untuk diperiksa.

Tabel 1. Validasi Sediaan Tablet

NO	TAHAP PEMBUATAN	PENGAMBILAN CONTOH	PARAMETER YANG DIPERIKSA	PEMERIKSA	JUMLAH CONTOH YANG DIAMBIL
1	Premixing	Diambil minimal 10 titik pada bagian atas, tengah dan bawah wadah penyampur	Ø Keseragaman kadar Ø Bulk dencity Ø Moisture content	QC unit Produksi Produksi	10 @ 3xberattablet + 100 gram + 100 gram
2	Mixing	Diambil minimal 10 titik pada bagian atas, tengah dan bawah wadah penyampur	Ø Keseragaman kadar Ø Bulk dencity Ø Moisture content	QC unit Produksi Produksi	10 @ 3xberattablet + 100 gram + 100 gram
3	Drying (Powrex)	Diambil minimal 3 titik pada bagian atas, tengah dan bawah alat pengering	Ø Moisture content	Produksi	+ 5 gram
4	Sieving	Diambil pada bagian atas, tengah dan bawah	Ø % fines Ø Bulk dencity Ø Particle size	Produksi Produksi Produksi	+ 50 gram
5	Lubrikasi	Diambil minimal 10 titik pada bagian atas, tengah dan bawah	Ø Keseragaman kadar Ø Yield	QC unit Produksi	10 @ 3xberattablet
6	Compressiontablet	Pada awal, tengah dan akhir pencetakan	Ø Keseragaman bobot Ø Kekerasan Ø Keregasan Ø Waktu hanncur Ø Ukuran (tebal; panjang) Ø Susut pengeringan (bila ada) Ø Tes disolusi Ø Keseragaman kadar	Produksi Produksi Produksi Produksi Produksi QC unit QC unit QC unit	Setiap jam @ 20 tablet Setiap 2jam@10 tablet Setiap 2jam@10 tablet Setiap 2jam@10 tablet Setiap 2jam@10 tablet Total 109 3 interval @ 8 tablet 20 interval @ 7 tablet
7	Coating	Diambil pada tahapsubcoated, precolouring dancolouring	Ø Berat Ø Susut pengeringan Ø Penampakan	Produksi Produksi Produksi	+ 100 tablet

Tabel 2. Validasi Sediaan Krim

NO	TAHAP PEMBUATAN	PENGAMBILAN CONTOH	PARAMETER YANG DIPERIKSA	PEMERIKSA	JUMLAH CONTOH YANG DIAMBIL
1	Premixing	Diambil minimal pada bagian atas, tengah dan bawah wadah penyampur, kecuali keseragaman kadar pada 10 titik.	Ø Keseragaman kadar Ø Berat jenis Ø Homogenitas Ø Viskositas Ø Dropping point Ø Osmolalitas Ø Cemaran mikroba Ø pH	QC unit QC unit QC unit QC unit QC unit Mikrobiologi QC unit	+ 100 gram
2	Filling	Diambil pada bagian awal, tengah dan akhir pengisian	Ø Filling weight Ø Cemaran mikroba	QC unit Mikrobiologi

Validasi pembersihan untuk ruangan

Selain validasi proses, validasi pembersihan untuk ruangan juga dilakukan. Aspek-aspek yang harus diperhatikan dalam melakukan validasi ini adalah:

Ø karakteristik bahan aktif

Ø desain ruangan

Ø jenis/tipe desinfektan yang digunakan

Ø jenis/tipe detergen yang digunakan

Ø prosedur pembersihan dan sanitasi

Ø metode analisis yang digunakan

Validasi mikrobiologi untuk ruang bersih dilakukan pada 2 kondisi ruangan yaitu:

Ø Pada saat ruangan kosong / istirahat setelah proses pembersihan atau desinfeksi selesai dilakukan (Unmanned)

Ø Pada saat ruangan sedang digunakan / ada karyawan yang sedang bekerja (manned).

Validasi pembersihan untuk peralatan

Proses pembersihan peralatan akan segera dilaksanakan setelah suatu produk selesai dibuat dan atau dikemas. Untuk mendapatkan peralatan yang bersih dan memenuhi persyaratan yang ditetapkan maka cara pembersihan dan detergen yang digunakan harus sesuai dengan PROTAP yang ditetapkan. Untuk itu prosedur pembersihan yang digunakan tersebut harus divalidasi untuk memastikan bahwa prosedur tersebut tepat / efektif untuk menghilangkan sisa produk sebelumnya dan detergen yang digunakan, termasuk untuk melihat cemaran mikrobanya. Validasi pembersihan minimal dilakukan 3 kali.

Pharmaceutical Entrepreneur

Selasa, 28 Agustus 2018

Selasa, 01 Desember 2015

Validasi dan Verifikasi Metode Analisis

Senin, 23 November 2015

VALIDASI PROSES